دانلود پایان نامه

ترکیبات درج شده بر روی بر روی برچسب نمونه های مورد مطالعه از آزمونجوی پلیفسفاتها در گوشت و فرآوردههای آن
جهت بررسی و اندازه گیری پلی فسفات ها در گوشت و فرآورده های غذایی از مراحل زیر استفاده می شود (Klose, Campbell et al. 1963):
• تهیه لایه سلولزی
• تهیه نمونه مورد آزمایش
• تهیه سرم
• جداسازی کروماتوگرافی
• تعیین فسفاتها

1-5-2-آزمایشات میکروبی
دستگاههای آزمایشگاه میکروبی، آون، 3 تا انکوباتور با دماهای مختلف، هود باکتریولوژیکی، اتوکلاو، روش های سریع (rapid) (یکسری محیط کشتهایی است که تا 24 ساعت جواب میدهد و با تغییر رنگ بستگی به نوع تغییر رنگ مشخص میکند که سالمونلا، اشیرشیا و … وجود دارند.) میباشد (Ellis, Broadhurst et al. 2002).
1-5-3-روش اندازه‏گیری رطوبت گوشت و فرآورده‏های آن
ظرف را که حاوی 4-3 برابر وزن نمونه مورد آزمون شن است همراه با میله بلوری به مدت نیم ساعت در اتوو 2 ± 103 درجه خشک کنید و بگذارید که ظرف و محتویات آن در دسیکاتور تا درجه حرارت آزمایشگاه سرد شود و سپس با دقت یک میلیگرم آن را توزین کنید. 10-5 گرم از نمونه آماده شده را به ظرف منتقل کرده و مجددا به دقت یک میلیگرم آن را توزین کنید.
برحسب وزن نمونه 10-5 میلیلیتر الکل اتیلیک به ظرف اضافه کرده به وسیله میله طوری مخلوط کنید و آن را روی حمام آب که درجه حرارت آن برای جلوگیری از بیرون انداختن قسمت‏هایی از نمونه بین 80-60 درجه تنظیم شده حرارت دهید و گاهی بهم زنید تا الکل تبخیر شود. ظرف و محتویات آن را مدت 2 ساعت در اتوو که در 2 ± 103 درجه تنظیم شده حرارت دهید، سپس ظرف را از اتوو به دسیکاتور منتقل نمایید و آنگاه بگذارید ظرف تا درجه حرارت آزمایشگاه سرد شود و سپس به دقت یک میلی‏گرم آن را توزین کنید. عملیات بالا را تکرار کنید تا نتیجه دو توزین پشت سرهم که با یک ساعت حرارت دادن از هم فاصله داشته باشند بیش از 1/0% وزن نمونه اختلاف نداشته باشد.

1-5-4-تعیین pH گوشت و فرآوردههای آن
الکترود را داخل نمونه قرار می دهند و سیستم تصحیح دمای pH متر را با دمای نمونه تنظیم می نمایند. نمونه را با همزن بهم زده تا همگن شود و سپس با استفاده از pH متر، pH را اندازه شود. همچنین برای اندازه گیری PH در فرآورده های غیرهمگن، با یک کارد سوراخی در نمونه ایجاد نموده تا در موقع قرار گرفتن الکترود در آن موجب شکستگی نگردد. دمای نمونه را تنظیم نموده و سپس pH را با استفاده از pH متر اندازهگیری نمایید.

1-5-5-اندازه‏گیری پروتئین تام در گوشت و فرآورده‏های آن
در حدود 2 گرم از نمونه آماده شده را در کاغذ صافی کوچک و یا یک ورقه کوچک آلومینیومی که قبلاً توزین شده به دقت 1/0 میلی‏گرم توزین کرده و در داخل بالن هضم بیاندازید. سپس 20 میلی‏لیتر اسید سولفوریک غلیظ و 8 گرم از مخلوط کاتالیزور (96 درصد سولفات پتاسیم و 5/3 درصد سولفات مس و 5/0 درصد اکسید سلینوم) به آن افزوده و بالن را به دستگاه مخصوص هضم کلدال وصل کرده و حرارت دهید. حرارت باید در ابتدا ملایم بوده و پس از این‏که محتوی بالن دیگر کف نکرد حرارت را زیاد کنید و ‏گاهی بالن را به هم بزنید. حرارت را آن‏قدر ادامه دهید تا مواد آلی هضم شود و مایع تقریبا بی‏رنگی در ته بالن باقی بماند سپس حرارت را مدت 5/0 تا 1 ساعت ادامه دهید. هرگاه دیواره بالن آلوده به نمونه باشد بایستی پس از سردشدن بالن هضم آن را با مقدار کم آب مقطر شسته تا تمام نمونه در ته بالن جمع شود سپس مجددا آن را حرارت داده تا مواد آلی کاملا هضم شود. بالن را بگذارید سرد شود و سپس آن را با 400 میلی‏لیتر آب مقطر در دفعات مکرر شستشو داده و از راه قیف مربوط به بالن تقطیر به داخل آن بریزید. عمل شستشوی بالن هضم را چندین مرتبه تکرار کنید تا مطمئن شوید تمام قسمت هضم شده به بالن دستگاه تقطیر وارد شده و چیزی از آن هدر نرفته باشد سپس چند قطعه سنگ جوش به آن بیفزایید. در زیر مبرد دستگاه تقطیر یک ارلنمایر محتوی 500 میلی‏لیتری محتوی 50 میلی‏لیتر محلول اسیدبوریک و چند قطره متیل قرمز قرار دهید. دستگاه تقطیر را با دقت نصب کنید و توجه داشته باشید که شیر آب مربوط به مبرد باز باشد و قسمت‏های مختلف دستگاه به طور محکم به هم مربوط باشند. سپس از راه قیف به مقدار کافی محلول سود 50% بیفزایید تا محیط قلیایی شود (حداقل 75 میلی‏لیتر سود لازم است) بالن را حرارت دهید و عمل تقطیر را در حالی‏که انتهای مبرد در محلول اسید بوریک قرار دارد ادامه داده تا تمام آمونیاک موجود در ظرف گیرنده جمع شود.
در حدود 200 تا میلی‏لیتر از محلول تقطیر شده را جمع‏آوری نموده ابتدا شیر قیف را باز کرده و سپس حرارت را قطع کنید و انتهای مبرد را از داخل محلول اسید بوریک خارج کرده و پس از چند دقیقه تقطیر آزاد حرارت را قطع کنید و قسمت خارجی مبرد را با کمی آب مقطر به داخل ارلنمایر بشویید و محلول را به وسیله اسید سولفوریک 1/0 نرمال تیتر کنید. همین آزمایش را برای محلول شاهد انجام دهید.

مطلب مرتبط :   منبع پایان نامه با موضوعمنابع حقوق، حقوق متهم

1-6-تکنیک های کاربردی در شناسایی گونه های گوشتی
علاوه بر تکنیک های کلی ذکر شده جهت کنترل کیفی عام فرآورده های غذایی، تکنیک های متعددی وجود دارند که می توان از آن ها برای شناسایی گونه های استفاده شده در تهیه فرآورده های گوشتی استفاده نمود. مهمترین تکنیک هایی که در حال حاضر برای شناسایی گونه های گوشتی می توان از آنها استفاده نمود در شکل 1-1 و مهمترین تکنیک های کاربردی برای شناسایی پروتئین گیاهی سویا در شکل1-2 خلاصه شده است.

شکل 1-1-تکنیک های موجود برای شن
اسایی گونه های گوشتی

شکل 1-2-تکنیک های موجود برای شناسایی پروتئین گیاهی سویا
1-6-1- تکنیک های مبتنی بر پروتئین
مرحله اولیه برای بررسی پروتئین ها جداسازی پروتئین ها از نمونه ها است. از مهمترین و معتبرترین روش های جداسازی پروتئین ها می توان به الکتروفورز و کروماتوگرافی اشاره نمود. الکتروفورز اولین بار توسط شیمیدان سوئدی آرن تیسلیوس ابداع شد. در سال 1937، تیسلیوس روشی برای جداسازی الکتروفورتیک پروتئین های سرم ابداع کرد. انگیزه اصلی برای طراحی این روش، که بعدها به الکتروفورز منطقه ای مشهور شد، مشکلاتی بود که در حین بررسی پروتئین های سرم وجود داشت. تیسلیوس برای اولین بار فراکنش های آلفا، بتا، و گاما را در سرم تشریح و نام گذاری کرد. وی به خاطر تحقیق بر روی الکتروفورز و آنالیز جذبی، بخصوص اکتشافاتی که ماهیت پیچیده پروتئین های سرم را مشخص می کرد، جایزه نوبل شیمی را در سال 1948 از آن خود کرد (Altria 1999). از دیگر روش های قدیمی کروماتوگرافی است که خود دارای انواع مختلفی است که اولین نوع آن را می توان کروماتوگرافی ژلی در نظر گرفت. این نوع کروماتوگرافی برای اولین بار در سال 1954 معرفی و در سال 1959 اصلاح شد. در این روش، جداسازی‌هایی مبتنی بر الک کردن مولکولی بر روی اجسام بی‌بار در جریان مهاجرت الکترو اسمزی از داخل ژل‌ها انجام می‌شود. بدین ترتیب که جداسازی بر مبنای اندازه‌های نسبی مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسیله ژل استفاده می‌شود. ژل استفاده شده در این روش باید بی اثر و پایدار باشد. در ادامه پس از دهه 80 میلادی با توجه به نیاز به ابداع روش های جدید تجزیه تحلیل پروتئین ها با دقت بسیار بالا بر اساس ساختار و عملکرد پروتئین و واکنش بین پروتئین ها جهت جداسازی، ‏شناسایی و تشخیص پروتئین های روش های فوق الذکر ارتقاء پیدا کردند که شامل تکنیک های کاربردی نظیر جدایی پروتئین محلول در آب به وسیله نشاسته، ‏پلی آکریل آمید یا الکتروفورز ژل آگارز‎ ‎، الکتروفورز دو بعدی، کروماتوگرافی مایع و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بود (Abramson, Moyer et al. 1942; Lopez 2007).
به طور کلی، در اغلب روش ‏های الکتروفروتیک مربوط به شناسایی گونه ها در گوشت خام، از پروتئین های سارکوپلاسمی استفاده می شود که این موضوع به ‏دلیل دمای بالاتر دناتوراسیون و حلالیت بیشتر پروتئین های سارکوپلاسمی نسبت به سایر پروتئین ها می باشد. از جمله روش های دیگر مبتنی بر پروتئین ها که هیچ ارتباطی به استخراج پروتئین ها ندارد، استفاده از مطالعات بافت شناسی می باشد که در آن پس از تهیه لام های بافتی، توسط آنتی بادی های منوکلونال اختصاصی یک پروتئین خاص هدف گیری شده و توسط میکروسکوپ فلورسانس مورد مطالعه و بررسی قرار می گیرد. این روش نیز کاربرد فراوانی در شناسایی منشأ بافتی و گونه ای نمونه های گوشتی دارد (Stamoulis, Stamatis et al. 2010; Soares, Amaral et al. 2013).

1-6-2- تکنیک های مبتنی برDNA ‏‎ ‎
با توجه به زمانبر بودن و مشکلاتی که در روش های تشخیصی مبتنی بر پروتئین وجود دارد، روش مبتنی بر DNA بر پایه PCR به علت سادگی، اختصاصیت و ویژه بودن و حساسیت این روش برای بررسی کیفیت و سلامت غذایی و تخمین ترکیبات غذایی مناسب تر است و می تواند جانشین مناسب تری برای روش های ایمنی شناسی موجود برای شناسایی گونه های گوشتی شود. مزیت دیگر PCR بر علاوه توانایی تمایز بین گونه های بسیار نزدیک در غذاهای ترکیبی و پیچیده مثل محصولات گوشتی ماریناد شده و حرارت دهی شده ، حتی می تواند برای تمایز منشأ بافتی درون گونه ای نیز استفاده شود (Meyer, Chardonnens et al. 1996).
تکنیک PCR با توجه به حساسیت ویژه و توانایی کابرد حتی در مقادیر بسیار اندک در محصولات خام و فرآوری شده و سرعت باعث می شود که روش های تکثیر DNA در بازبینی و بررسی موادغذایی، شناسایی مواد غذایی اصلاح ژنتیک شده و شناسایی تقلبات در فرآورده های غذایی کاربرد فراوانی داشته باشند (Mafra, Silva et al. 2008).

مطلب مرتبط :   مقاله رایگان با موضوعمنابع حقوق، حقوق تجارت، حقوق جزا

1-6-2-1-واکنش زنجیره پلیمراز (PCR)
1-6-2-1-الف-اطلاعات اولیه
این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده، استفاده کرد. PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم، بوجود آمد. امروزه دستگاه هایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آن ها جایگاه های لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است (Eckert and Kunkel 1991).

1-6-2-1-ب-تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود (Arnheim and Erlich 1992).

1-6-2-1-ج-مراحل PCR
مرحله دناتوراسیون:
DNA در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30 ثانیه) قطعات DNAرا در درجه حرارت 94 درجه سانتی گراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.

مرحله آغازگر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی:
این قطعات معمولاً از 25-18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار دارند، اتصال یابند. قطعه‌ای که د
ر آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود، در واقع ما بین دو آغازگر قرار دارد. مرحله اتصال آغازگرها کوتاه بوده و حدوداً 30 ثانیه در دمای 65-30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.
مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز:
در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان آغازگر مورد نیاز است. مراحل کلی PCR در شکل 1-3 شنان داده شده است.
ادامه PCR بعد از چرخه اول:
بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است (Innis, Gelfand et al. 1990).

شکل1-3-مراحل مختلف تکنیک PCR

1-6-2-1-د-کاربردهای مهم PCR
تهیه نسخه های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتاً زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود (Zhang and Zhang 2002).
بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژن های مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.
تشخیص بیماری های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن آغازگرهای مربوط به یک ژن بیمار و آغازگرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از آغازگرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصراً ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آن هاست.
تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله آغازگرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلاتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.
تشخیص بیماری ها: کشت میکروب ها که جهت تشخیص بیماری های عفونی در اکثر آزمایشگاه ها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاه ها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و آغازگرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این آغازگرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن


دیدگاهتان را بنویسید