فایل دانشگاهی – بررسی ارتباط چندشکلی های ژنتیکی ژن های GSTM1 ، GSTT1 و CAT با …

محصول PCR برای ژن کاتالاز یک قطعهی ۱۹۰ جفت بازی میباشد. که پس از انجام PCR نیاز به آنزیم محدودکننده برای برش ژن کاتالاز داریم. مواد مورد استفاده برای برش ژن کاتالاز پس از PCR
آب استریل
آنزیم محدودکنندهی EcoRV
بافر H
مقدار مورد استفاده برای انجام RFLP برای ژن CAT در هر نمونه بصورت زیر میباشد:
آب استریل: ۵/۱۷ میکرولیتر
آنزیم محدودکننده EcoRV: 5/0 میکرولیتر
بافر H: 2 میکرولیتر
محصول PCR : 10 میکرولیتر
پس از تهیهی مخلوط فوق آن را spin downکرده، و آن را به مدت۳۰/۱۶ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار میدهیم.
۳-۷: الکتروفورز
۳-۷-۱: مواد مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز
آگاروز
TBE 5X
TBE 0/5X
۶x loading buffer
DNA ladder
اتیدیوم بروماید
۳-۷-۲: طریقهی تهیهی محلولهای مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز
– TBE 5X
۵۴ گرم Tris base و ۵/۲۷ گرم Boric Acid را وزن کرده و در داخل شیشهی یک لیتری میریزیم و ۲۰ میلی لیتر EDTAرا بر روی آن ریخته سپس مقدار کمی آب به آن اضافه میکنیم و خوب هم میزنیم و پس از هم زدن حجم آن را به ۱۰۰۰ میرسانیم.
– TBE 0/5X
۱۰۰ میلی لیتر از TBE 5X را با ۹۰۰ میلی لیتر آب تصفیه شده مخلوط کرده و پس از هم زدن خوب TBE 0/5X برای استفاده آماده است.
محلول اتیدیوم بروماید برای رنگ آمیزی ژل
میکرولیتر از رنگ اتیدیوم را در ۷۰۰ میلی لیتر TBE 0/5X حل میکنیم
محلول EDTA
۳۸/۵ گرم EDTA را در ۳۰ میلی لیتر آب تصفیه شده حل کرده و PH آن به ۸ میرسانیم
۳-۷-۳: الکتروفورز GSTM1 و GSTT1 و رنگ آمیزی ژل
پس از انجام PCR قطعات DNA حاصل را در چاهکهای ژل اگارز %۵/۱ load کرده (جهت درست کردن ژل آگاروز از مایکروفر استفاده می شود) و پس از اتصال جریان برق DNA چون دارای بار منفی هست به طرف قطب مثبت حرکت کرده، وقتی بر روی ژل مسافتی بیش از نصف طول ژل را طی کرد آن را در درون رنگ اتیدیوم بروماید در حدود ۱۰ دقیقه قرار میدهیم و پس از رنگآمیزی در دستگاه Gel Documentation آن را مشاهده خواهیم کرد. اگر شخص مورد نظر برای هر دو تا ژن GSTM1 و GSTT1 نول باشد، فقط یک باند که مربوط به ژن بتا-گلوبین است دیده خواهد شد، که طول این باند ۲۶۸ جفت باز میباشد. اگر شخص مورد نظر برای ژن GSTT1 نول باشد، باند مربوط به ژن بتا-گلوبین و ژن GSTM1دیده خواهند شد، که طول این باندها به ترتیب ۲۶۸ و ۲۱۹ جفت باز میباشند. اگر فردی هر دو تا ژن GSTM1 و GSTT1 را داشته باشد سه باند ژنی که مربوط به ژن های GSTT1، بتا-گلوبین و GSTM1 است دیده خواهند شد. که طول آنها به ترتیب ۴۵۹، ۲۶۸ و ۲۱۹ جفت باز می باشند. در شکل ۱-۳ ژنوتیپ مربوط چندشکلی ژن های GSTM1 و GSTT1 نشان داده شده است.
شکل ۳-۱- یک نمونه از آنالیز multiplex-PCR مربوط به چندشکلی ژن های GSTM1 و GSTT1
خط۱: مارکر ۱۰۰ جفت بازی، خط۲: present/GSTT1-present GSTM1-، خط۳: null/GSTT1-present GSTM1-، خط۴: null/GSTT1-null GSTM1-، خط۵: present/GSTT1-null GSTM1-
۳-۷-۴- الکتروفورز PCR-RFLP برای ژن کاتالاز و رنگآمیزی ژل
قطعات DNA حاصل ازPCR-RFLP را جهت تعیین ژنوتیپ کاتالاز بر روی چاهکهای ژل آگارز ۵/۱ درصد load کرده و پس از اتصال جریان برق DNA چون دارای بار منفی هست به طرف قطب مثبت حرکت کرده، وقتی بر روی ژل مسافتی بیش از نصف طول ژل را طی کرد آن را در درون رنگ اتیدیوم بروماید در حدود ۱۰ دقیقه قرار میدهیم و پس از رنگ آمیزی در دستگاه Gel Documentation آن را مشاهده خواهیم کرد.
بر روی ژل سه نوع ژنوتیپ دیده میشود که عبارتند از: CC، CT، T
ژنوتیپ CC که ژنوتیپ وحشی ژن C-262T است توسط آنزیم EcoRV برش خورده و باعث ایجاد باندهای ۱۵۷ و۳۳ جفت بازی میشود. اگر ژن کاتالاز ۲۶۲- جایگاهی برای برش آنزیم EcoRV نداشته باشد فقط یک باند ۱۹۰ جفت بازی بر روی ژل مشاهده میشود که نشان دهندهی ژنوتیپ TT میباشد. و اگر یکی از رشته ها جایگاه برش داشته باشد و دیگری نداشته باشد بر روی ژل سه باند ۱۹۰، ۱۵۷و ۳۳ جفت بازی مشاهده میشود که نشان دهنده‌ی ژنوتیپ CT میباشد. در شکل ۳-۲ ژنوتیپ این چند شکلی دیده میشود.

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  ۴۰y.ir  مراجعه نمایید.