دانلود پایان نامه

مخلوط اصلی تهیه شده مطابق جدول 2-2، در چرخه دمایی مذکور در جدول 2-5 قرار می گیرد تا واکنش Simplex PCR تکمیل گردد.

مرحله
دما(سانتی گراد)
زمان(دقیقه)
تعداد چرخه

Denaturing
95
2
1

Denaturing
annealing
extention
94
60
72
1
1
’30/1

35

Final extention
72
5

جدول2-5- چرخه دمایی Simplex PCR‏ ‏

2-8-2-3-انجام تست حساسیت PCR

برای شناسایی و تائید آغازگرهای گونه های خاص 20 نانو گرم از DNA هر گونه (گاو،گوسفند،مرغ و سویا)تهیه شد. برای تعیین و تشخیص محدودیت هر اغازگر اختصاصی به ترتیب رقت 1:10 ( 50 ، 25، 5/0، 05/0، 005/0، 0005/0 وng DNA /μl 00005/0) از گوشت خام (گاو،گوسفند، مرغ) و پروتئین گیاهی سویا تهیه شد و به هر رقت به طور جداگانه مخلوط واکنش اضافه گردید.

2-8-2-4- بررسی محصولات PCR
روش رایجی که برای بررسی کیفی یا کمّی، وجود یا عدم وجود و یا مقدار تولید محصول PCR استفاده می شود الکتروفورز منطقه ای یا الکتروفورز صفحه ای محصول PCR در ژل آگارز است. جهت دیدن محصول PCR در ژل باید از آگارزهای استاندارد (DNA-grade) استفاده کرد. آگارز یک پلی ساکارید است که از واحد های تکرار شونده آرابینوز دی ساکارید تشکیل شده است. هنگامی که پودر آگارز در اثر حرارت در بافر خود به حالت ژل در می آید در واقع شکل مولکول های پلیمر، از حالت حلقوی نامنظم به شکل مولکول های مارپیچی دوتایی تبدیل می شود. این پدیده یک شبکه از منافذ با قطر 100 الی 300 نانومتر تولید می نماید که اندازه این منافذ وابسته به عوامل متعددی است که یکی از آنها غلظت آگارز می باشد، هرچه غلظت بالاتر باشد منافذ ریزتری به وجود می آورد که قدرت تفکیک اندازه DNA مورد بررسی را کاهش می دهد.

مطلب مرتبط :   منبع پایان نامه با موضوعقانون مجازات، حقوق جزا

فصل سوم
• بحث و بررسی داده های تحقیق

3-1-نتایج
‌کیفیت و کمّیت DNA استخراج شده از هر نمونه به ترتیب با استفاده از نانودراپ بررسی شد. با توجه به اینکه میزان جذب نوری 280/260 در محدوده 8/1 تا 2 بوده است، لذا نشان دهنده مطلوب بودن روش استخراج DNA جهت انجام PCR ژن های مورد نظر بود. یک نمونه ازDNA استخراج شده در شکل 3-1 نمایش داده شده است.

شکل3-1-نانودراپ DNA استخراج شده
3-1-1-بررسی عدم واکنش تداخلی آغازگرها (cross reaction)
در ادامه پس از استخراج DNA از نمونه های گوشت مرغ ،گوسفند،گاو و همچنین از سویای بافت دار خشک به منظور اطمینان از عملکرد اختصاصی هر آغازگر و عدم واکنش متقاطع آغازگرها،‌ آزمایش Simplex-PCR هر آغازگر با DNA های هدف و غیر هدف با سه بار تکرار انجام شد. تنها یک باند شفاف با دانسیته خوب برای نمونه DNA گاوی مشاهده شده است که نشان دهنده عدم واکنش متقاطع این آغازگر با نمونه های غیر هدف است.

شکل3-2-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون اختصاصی بودن آغازگر گاوی. 1: ( DNA گاو)، ‏‎2: (DNA گوسفند)، 3: (DNA مرغ)، 4: (DNA سویا)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد استفاده (M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR.

پس از تأیید آغازگر گاوی، آزمون تأییدی PCR برای آغازگر گوسفندی با شرایط مشابه انجام گرفت و همانطور که در شکل 3-3 نشان داده شده است این آغازگر نیز به طور اختصاصی تنها به نمونه DNA گوسفندی متصل شد و آنرا تکثیر نمود.

شکل3-3-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون اختصاصی بودن آغازگر گوسفندی. 1: ( DNA گوسفند)، ‏‎2: (DNA گاو)، 3: (DNA مرغ)، 4: (DNA سویا)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد استفاده(M100 bp) برای تعیین اندازه محصولات PCR.

مطلب مرتبط :   دانلود تحقیق در موردسلسله مراتب، چند شاخصه

پس از تأیید آغازگر گوسفندی در ادامه آزمون تأییدی PCR برای اختصاصی بودن آغازگر سویا با شرایط مشابه انجام گرفت و همانطور که در شکل 3-4 نشان داده شده است این آغازگر نیز به طور اختصاصی تنها باDNA سویا واکنش می دهد و هیچ گونه تمایلی برای اتصال به دیگر DNA ها ندارد.

شکل3-4-الکتروفورز محصولات PCR‏ برای آزمون اختصاصی بودن آغازگر سویا. 1: ( DNA سویا)، ‏‎2: (DNA گاو)، 3: (DNA گوسفند)، 4: (DNA مرغ)، C- (کنترل منفی) و M نشانگر وزنی مورد


دیدگاهتان را بنویسید